尽管免疫疗法已取得重大突破，仍有超过70%的肝细胞癌（HCC）患者对免疫检查点抑制剂治疗无响应。肿瘤的免疫组织结构很可能与免疫疗法的疗效关联，但先前利用组织转录组或蛋白组数据得出的免疫特征未能直接预测肝细胞癌免疫疗法的疗效。
现在，新兴的组织成像质谱流式（IMC）技术提供了一种独特的单细胞空间靶向蛋白组学解决方案。该技术利用金属标签抗体代替荧光标签抗体，解决了传统方法中荧光的串色问题，可在同一张切片上对超过40种抗体同时染色，并在亚细胞分辨率上使用飞行时间质谱对所有金属标签进行同时检测，无需循环染色或循环洗脱等繁复的实验流程。因此，IMC可对肿瘤细胞、免疫细胞等多种细胞类型实现精确表征并保存它们的空间位置信息，从而帮助解码肿瘤免疫微环境。
2024年10月，德国弗莱堡大学医学院的研究团队在《Gut》（IF 23）上发表文章，利用IMC对肝细胞癌完成包含空间信息的单细胞多参数免疫网络分析，并鉴定出与免疫疗法预后相关的免疫表型分类。作者首先分析了54例HCC病人组织切片样品，使用41个标志物的IMC panel对主要免疫细胞群体、免疫检查点、肝实质细胞及肿瘤细胞等进行了精细表征（图1）。
图1. 研究流程
通过深度学习算法进行细胞划界得到单细胞数据后，作者使用PhenoGraph聚类得出肿瘤细胞、肝细胞、基质细胞及免疫细胞等23类细胞亚群，再次体现了肝癌微环境中广泛的异质性。为了独立分析肿瘤微环境中不同区室，作者区分了肿瘤实质和肿瘤内基质，发现T细胞、B细胞、抗原提呈细胞（APC）等免疫细胞在基质中的密度明显高于肿瘤实质中（图2）。
图2. (D) 热图显示各细胞亚群各标志物表达量；(E) 代表性HCC组织中的细胞亚群；(F) UMAP展示免疫细胞亚群；(G) 各样本中免疫细胞含量；(H) 肿瘤实质及基质中的免疫细胞数量
为进一步解读HCC免疫微环境，作者根据免疫细胞的空间位置进行聚类，得出三种独特的免疫邻域关系（immune neighbourhood，IN）。其中IN1以CD8 T细胞和浆细胞为主要特征，IN2富含浸润的巨噬细胞和粒细胞等髓系细胞，IN3主要富集了B细胞和CD4 T细胞。对各IN内的细胞间相互作用分析显示IN1具有激活的抗肿瘤免疫反应，而IN2和IN3呈现出不同的免疫抑制特征（图3）。因此，免疫细胞在肝细胞癌内组成不同的邻域关系，它们所包含的细胞类型和相互作用显示了不同区域激活或抑制性的免疫微环境。
图3. (A) 根据免疫细胞相互作用聚成三种IN；(D) 各IN中免疫细胞的相对含量；(G) 各IN中10种最显著的免疫细胞亚群间相互作用
为了将空间免疫表型转化为
能够指导临床实践的指标，作者根据已有数据选择了一种简化的方法，用浸润CD8 T细胞的数量和分布制订了一种空间免疫分类方案。CD8 T细胞少于200个/mm2的为免疫缺失型（depleted，58.5%），而超过200个/mm2的又根据它们在肿瘤实质和基质中的比例小于或大于0.5分为区室型（compartmentalised，18.9%）或富集型（enriched，22.6%）。在后两类中，基质中CD8 T细胞数量相似，而肿瘤实质中的数量差异决定了总数的差异。这种简化的分类法还足以区分出明显的免疫细胞数量和邻域关系类别的不同（图4）。作者继续分析了肿瘤基因突变和发病的风险因素，发现二者均不能预测空间免疫分类。这说明空间免疫分类可作为独立指标提供关于肿瘤的重要信息。
图4. (D) 空间免疫分类方案示意图；(E) 各分类中CD8 T细胞总数和各区室内的数量；(H) 各分类中各IN及其相互作用（灰线）的示例图片和数量
研究接下来分析了空间免疫分类能否预测免疫疗法疗效。治疗响应者中仅有区室型或富集型，并且分类为富集型的患者在治疗后至少维持了疾病稳定。生存分析表明富集型的患者无进展生存时间最长，而缺失型和区室型病程进展较快。作者还探索了免疫邻域关系本身能否作为预后标志物，发现IN1（富集型中的主要IN类型）可预测8个月生存率，且高密度IN1对应更长的无进展生存（图5）。
图5. (A) 免疫治疗后部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）患者的空间免疫分类比例；(C) 三种空间免疫分类患者的无进展生存期；(E) IN类型预测8个月无进展生存的准确性；(F) IN1区分患者的无进展生存期
本文作者充分利用IMC多通道且无自发荧光的优势，构建了多参数单细胞空间图谱，并得到了与免疫疗法预后相关的空间免疫类型。本研究再次表明癌症研究中免疫细胞空间分布的重要性。免疫空间分类可作为指导精准医疗的生物标志物，在治疗前更好地实现患者分层。IMC在开发这一方案的过程中起到了至关重要的作用。
参考文献：Salié et al. Spatial single-cell profiling and neighbourhood analysis reveal the determinants of immune architecture connected to checkpoint inhibitor therapy outcome in hepatocellular carcinoma. Gut. 2024 Oct 14:gutjnl-2024-332837.
