多发性硬化症是一种中枢神经系统的慢性炎症性疾病，也是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病。多发性硬化症的病因学涉及多基因风险变异和环境触发因素之间的复杂相互作用。因此，研究遗传易感性和环境诱因如何塑造个体免疫细胞的相互作用，对于理解包括多发性硬化症在内的自身免疫性疾病的病理生理学至关重要。 2022年2月16日，苏黎世大学和慕尼黑大学的研究人员在Nature杂志在线发表了题为Twin study reveals non-heritable immune perturbations in multiple sclerosis的文章[1]。作者对61对同卵双胞胎进行了深入分析，有趣的是，同卵双胞胎中，一人患有多发性硬化症，而另一人未患有多发性硬化症。同卵双胞胎们携带相同的遗传物质和所处的早期生活环境相同，从而消除了大部分可变遗传以及早期环境对异质人群的影响。作者利用Fluidigm质谱流式技术（CyTOF）和CITE-seq等多组学技术并结合机器学习算法全面而深入分析双胞胎的免疫系统，并解释为什么两个人具有相同的遗传易感性和受到相同早期环境影响，却能表现出不同的多发性硬化症临床表型(图1a)。 作者利用质谱流式技术，设计了2个panel，分别由37个marker组成，其中一个panel由表面蛋白和转录因子组成，对免疫细胞的表型，转运和激活状态进行分析，另外一个panel由表面蛋白和13个细胞因子组成，对不同类型免疫细胞的细胞因子和转运蛋白的表达情况进行分析。选取多发性硬化症患者和他们未受影响同胞的PBMCs样本进行检测，全面分析免疫细胞亚群的变化。为了降低样本间的实验误差，作者使用了Live Barcode技术，用带有不同金属标签的CD45抗体对样本标记，将几十个样本混在一起进行panel抗体染色和数据采集，不仅提高了检测通量，而且使数据更加精准，挖掘出低丰度蛋白的变化。采集的数据通过FlowSOM聚类和手动合并簇构建典型免疫细胞群的参考框架，另外结合贝叶斯算法的diffcyt工具，共鉴定了1400个免疫特征，每个特征代表了给定免疫簇中一个细胞状态标记的表达。从中寻找差异性免疫特征，差异特征需要满足两个条件：1）在所有双胞胎中能够区分多发性硬化症的患者和其健康同胞；2）不是由疾病修饰治疗诱发的(图1b)。共鉴定18个差异特征即差异状态节点，其中12个位于TH细胞区域，1个接近非传统的T细胞参考节点，3个接近自然杀伤(NK)细胞参考节点和其余2个位于髓系细胞区域(图1b)。其中，TH细胞和髓系细胞群体改变最为显著。
图1. 多发性硬化症临床表型不一致的双胞胎中循环TH细胞和髓系细胞表现出显著差异。a, CyTOF和CITE-seq来揭示环境触发的多发性硬化症免疫改变。b, Diffcyt自动分析并筛选出所有双胞胎和未接受多发性硬化症治疗的双胞胎之间不同的免疫特征(左)。网络可视化无监督聚类FlowSOM的免疫细胞群参考框架(米色：自动聚类节点，红色：差异状态节点) (右)。
质谱流式技术助力研究发现患有多发性硬化症双胞胎的免疫系统特征变化，即环境触发的多发性硬化症免疫改变：
髓系细胞——单核细胞的CCR2-CSF2R升高
多发性硬化症相关的单核细胞特征在差异状态节点中发现，单核细胞趋化受体2(CCR2) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体特异性亚基(CD116)蛋白在患有多发性硬化症的双胞胎中表达水平更高（图2a)。这种差异状态吞噬细胞节点的表型类似于经典单核细胞(图2a)。然而，CD14表达低，CD16不表达，阻碍了其归类为典型免疫亚群。CCR2和CD116在未治疗的双胞胎中表达尤其明显，表明这种特殊多发性硬化症相关的变化易受疾病修饰治疗的影响(图2a)，且对炎症刺激敏感。
图2.患有多发性硬化症的双胞胎的髓系细胞向单核细胞群转移，CCR2和GM-CSF受体的表达增加。
淋巴细胞——TH细胞的CD25增加
淋巴细胞是多发性硬化症双胞胎和未受影响双胞胎之间最显著的变化(图1b)。在固有淋巴细胞中，患有多发性硬化症双胞胎的NK细胞中CCR6表达增加，CXCR3和CD25的表达减少；NKT细胞节点中CCR6的表达降低(图3a)。CD4+效应记忆T细胞(TEMRA)节点中CXCR3表达显著降低，而CD69表达显著升高 (图3b)。 在双胞胎队列中，最主要的变化在TH细胞节点。8个簇是以明显地高表达CD25 (IL-2受体高亲和链) 为特征的初始TH细胞，其中一个节点CCR4表达增加，一个节点CD127表达减少(图3b)。初始TH细胞亚群中CD25高表达代表了多发性硬化症双胞胎循环免疫细胞中最普遍的免疫改变。转录组和伪时间分析进一步表明，该群体处于移行差异状态，初始标记(CD45RA和CCR7)下调和记忆相关蛋白质(CD45RO和CD25)上调。
图3. 患有多发性硬化症双胞胎的淋巴细胞变化。a, 固有淋巴细胞变化；b,TH细胞变化：高表达CD25。
细胞因子——初始TH细胞的IL-2增加
接下来作者研究了多发性硬化症双胞胎移行TH差异状态节点中CD25表达增加的功能意义。使用PMA(PKC激活剂)和离子霉素对临床表型不一致的同卵双胞胎的PBMCs进行刺激，利用含有12细胞因子标记物的panel，分析细胞因子和转运相关标记物变化情况(图3a)。TH细胞节点表现出初始表型，其特征是CD25及其配体IL-2表达增加(图3b)。通过扩展残疾状态量表(EDSS)评估双胞胎患者多发性硬化症的严重程度，发现移行TH细胞节点中IL-2表达差异与多发性硬化症的严重程度存在很强的正相关，且与处于复发缓解期多发性硬化症(RRMS)的双胞胎相比，继发性进行性多发性硬化症(SPMS)的双胞胎IL-2表达显著升高(图3c)。
图4. 患有多发性硬化症双胞胎的细胞因子变化。a, PBMCs以抗原非依赖的方式被激活，发现CD25高表达TH细胞节点，并分析其细胞因子和转运特征变化；b, 差异状态节点细胞中CD25和IL-2的表达水平；c, IL-2表达与多发性硬化症双胞胎扩展残疾状态量表(EDSS)的相关性。
这项研究作者巧妙地设计实验值得借鉴：1）选取多发性硬化症临床表型不一致的同卵双胞胎，排除遗传和早期环境因素的影响，从而发现环境因素影响的免疫特征；2）利用质谱流式技术在单细胞水平收集59个参数信息，全面深入分析免疫细胞表型和功能；3）采用Live Barcode技术，同时染色和采集配对双胞胎样本数据，降低样本间的实验偏差，从而发现初始TH细胞中整体表达相对较低的CD25，在临床表型不同的双胞胎间的差异，此特征为多发性硬化症最显著变化；4）独特的人工智能算法，识别出1400个免疫特征，并发现18个差异特征，揭示独特环境影响驱动的特异性免疫效应。 Fluidigm公司研发的质谱流式技术是一种高通量单细胞蛋白质分析技术，利用金属元素作为抗体的标签，以质谱作为检测手段，可同时分析单细胞表面和内部的50多种标志物，由于采用特殊的金属元素作为检测信号，背景信号极低，彻底解决传统流式的荧光串色的问题，并在多领域得到广泛应用。
参考文献：
1. Florian Ingelfinger, Lisa Gerdes et al. Twin study reveals non-heritable immune perturbationsin multiple sclerosis. Nature, 16 February 2022 DOI: 10.1038/s41586-022-04419-4
